Biomed_heft_0703

biomed_Heft_0703 16.11.2007 16:11 Uhr Seite 8 mellitus. Zusätzlich spielen genetischeVarianten in Genen von blutdruckre- gulierenden Proteinen für die Entste-hung dieser Veränderung eine Rolle.
Atherosklerotische Läsionen sind Lipi-dansammlungen in der Gefäßwand. Dieendotheliale Plaque verengt das Lumen Eine Assoziationsstudie zur Identifizierung genetischer Risikofaktoren cerebrovasculärer Erkrankungen. Auszug aus der Diplomarbeit „Single Nucleotid Polymorphismen im Stick- stoffmonoxid-Phosphodiesterasen-Signaltransduktionsweg“.
Die cerebrale Microangiopathie betrifftdie kleinen Arterien und Arteriolen und Vessel Disease (cSVD) bezeichnet. Höheres Lebensalter und q In Österreich erleiden jährlich 150 von arterielle Hypertonie sind gesicherte Risikofaktoren. Bei der 100.000 Personen einen Schlaganfall. Dieser Microangiopathie kommt es zu einer Hyalinisierung der Ge- cerebrale Insult stellt die dritthäufigste Todes- fäßwand, Muskelzellen gehen zugrunde, das Endothel dege- ursache in den Industriestaaten dar. Verantwortlich dafür neriert und begünstigt Rupturen und Thrombosen. Die Au- sind pathophysiologische Veränderungen im menschlichen toregulation des Gefäßes wird beeinträchtigt. Durch eine in- Organismus – abhängig vom Lebensstil des einzelnen Indi- timale Fibrose verengen sich die Lumina bis zum vollständi- viduums (äußere Einflüsse) und genetischen Faktoren (inne- gen Verschluss der Blutgefäße. Der Heretibilitätsindex der cSVD beträgt 70 %. Charakteristisch für die cerebrale Micro- Ich hatte im Rahmen der Österreichischen Schlaganfall angiopathie, über die nichtinvasive Diagnostik mittels Ma- Vorsorge Studie (ÖSVS) die Möglichkeit, eine genetische Va- riation auf ihr potenzielles Schlaganfallrisiko zu untersuchen.
Die ÖSVS beschäftigt sich mit der Auswirkung vasculärer Ri- Diese Alterationen entsprechen einer spongiösen Demyeli- sikofaktoren auf die Funktion und Morphologie des Gehirns.
nisierung des Marks und einer Wucherung von Gliazellen Als Kandidaten zur Untersuchung des genetischen Einflusses auf und Astrozyten. Die weiße Substanz wird atroph. Im MRT er- so genannte cerebrovasculäre Erkrankungen eignen sich vor al- scheinen die betroffenen Stellen hell.
lem Gene von blutdruckregulierenden Proteinen. Das ergibt sich aus der Tatsache, dass die Hypertonie ein gesicherter Risiko- Die Microangiopathie führt zu lakunären Infarkten. Darun- faktor dieser Erkrankungen ist. Ziel meiner Arbeit war es, ei- ter versteht man hohle, mit Liquor gefüllte Areale von unge- nen Single Nucleotid Polymorphismus (SNP) des Enzyms Phos- phodiesterase 4D (PDE4D) am Grazer Studienkollektiv derÖSVS zu untersuchen. Damit sollte die Assoziation diesesSNP45 mit cerebrovasculären Erkrankungen belegt werden.
Methodisch bediente ich mich der konventionellen Poly- merase Chain Reaction (PCR) mit anschließendem Restrik-tionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP).
Ein ischämischer Insult entsteht durch eine Minderper- fusion des Gehirns. Degenerative Veränderungen der Ge-fäßwand begünstigen das Entstehen von Thrombosen undführen meist zu einem plötzlichen Verschluss im Bereich derCarotiden. In der Folge erhalten die Nervenzellen zu wenigSauerstoff und Nährstoffe, sodass sie ihre üblichen Funktio- nen nicht mehr aufrechterhalten können. Das Absterben die- ser Nervenzellen führt zu dementsprechenden neurologi-schen, sensorischen oder motorischen Ausfällen.
Cerebrovasculäre Erkrankungen
Diese pathologischen Veränderungen in den Gefäßen des Gehirns sind multifaktorielle Erkrankungen, die durch die Die ÖSVS wurde 1991 von Univ. Prof. Dr. Reinhold Interaktion von Umweltfaktoren und genetischen Verände- Schmidt und Univ. Prof. Dr. Franz Fazekas gegründet und setzt rungen entstehen. Sie haben zwei Erscheinungsformen: sich aus einem freiwilligen Studienkollektiv von cirka 2.011 Pro-bandInnen zusammen. Die StudienteilnehmerInnen sind zwi- schen 50 und 75 Jahre alt und repräsentieren die durch- Die Macroangiopathie ist besser bekannt unter der Bezeich- schnittliche „normale“ ältere Bevölkerung in Graz. Die Studie nung Atherosklerose (der großen und mittelgroßen Arterien, ist rein deskriptiver Natur und analysiert potenzielle (genetische) daher „Macro“). Zu den gesicherten Risikofaktoren zählen Risikofaktoren cerebrovasculärer Erkrankungen. Zu den Aus- Hypercholesterinämie, Rauchen, Hypertonie und Diabetes schlusskriterien zählen u.a. bereits erlittene Schlaganfälle, De- biomed_Heft_0703 16.11.2007 16:11 Uhr Seite 9 menz oder neuropsychiatrische Erkrankungen. Zum Zeitpunkt Proteine. Der Genlokus befindet sich auf dem Chromosom meiner Diplomarbeit waren 950 TeilnehmerInnen einer Ma- 5q12. Das PDE4D Gen besteht aus 22 Exons mit einem Um- gnetresonanztomografie (MRT) und einer Dopplersonogra- fang von insgesamt 1,5 Megabasen und vier Promoterberei- phie der Halsgefäße (Carotiden) unterzogen worden. Die Dopp- lersonographie dient zur Feststellung der Plaquedichte in den PDEs werden in Zellen unterschiedlich stark exprimiert Carotiden und mittels der MRT werden die White Matter Le- sions und Lacunen in der Gehirnsubstanz erfasst. Von den Pro-bandInnen wurde eine DNA-Bank aus EDTA-Vollblut erstellt und fragestellungsspezifische Laborparameter bestimmt (großesBlutbild, Lipidstatus, Triglyceridkonzentration, Gesamtcho- Detektion des SNP45
lesterin, LDL, HDL, Lp(a) Lipoprotein, Plasmafibrinogen).
Zur Untersuchung eines möglichen genetischen Einflusses Berücksichtigt wurde auch die Präsenz eines Diabetes mellitus, der PDE4D auf cSVD wurde der SNP45 ausgewählt. Das ist Blutdruck- und EKG-Werte, der Raucherstatus und der BMI der ein bekannter SNP der PDE4D, der in einer isländischen Fall- Kontroll-Studie analysiert wurde. Die Untersuchungen desTeams ergaben eine starke Assoziation des SNP45 mit Schlag- anfällen, die auf die Macroangiopathie zurückzuführen sind.
Grundsätzlich sind SNPs natürlich auftretende, einzelne Enzymfunktion
Basenaustausche in der DNA-Sequenz. Ein SNP ist an ca. je- Die PDE4D ist eine Isoform der großen Phosphodie- der 1000sten Base anzutreffen und kann, wenn er innerhalb sterasen-Enzymfamilie. Exprimiert werden PDEs vor allem in der Exons liegt und Interaktionen mit anderen Faktoren ein- Myozyten, Monozyten, Makrophagen, Endothelzellen und T- treffen, die Zelle funktionell beeinflussen.
Lymphozyten und sie können im Cytosol, in der Membran,im Kern oder Zytoskelett der Zelle lokalisiert sein. Diese En- zyme sind für die Degradation der Second Messenger cycli- Mit der PCR wurde der Bereich des Gens der PDE4D am- sches Adenosinmonophosphat (cAMP) und cyclisches Gua- plifiziert, in dem sich der SNP45 befindet. Das amplifizierte nosinmonophosphat (cGMP) verantwortlich.
PCR-Produkt ist 448bp lang und wurde durch eine anschließ- Die intrazelluläre Konzentration des cGMP wird folgen- ende Agarosegelelektrophorese detektiert. Alle untersuchten dermaßen geregelt: Die Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOS) Proben stammen aus der DNA-Bank der ÖSVS.
beginnen durch einen Stimulus mit der Synthese von Stick- Es wurden folgende PCR-Konditionen festgelegt: stoffmonoxid (NO). NO bindet an seinen Rezeptor, die lös- 1. PCR-Ansatz
liche Guanylatcylase (sCG), die daraufhin cGMP freisetzt.
Passiert dies in den glatten Muskelzellen des Endothels, ■ Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs), 100μM kommt es zu einer cGMP-bedingten Vasodiladation mit ver- ■ Primer SNP45/5’ (CAT TCA GCC CTC TAC CAC bundener Blutdrucksenkung. Sobald cGMP erzeugt wird, kann es nur mehr durch die katalytische Aktivität der PDE zu Primer SNP45/3’ (CTT CTA AGA ACT GGC AGG 5`-GMP inaktiviert werden. Diese Senkung des cGMP-Spie- gels resultiert in einer Vasokonstriktion mit blutdruckstei- gernder Wirkung. Die Produktion von cGMP durch die NO- 2. Laufprotokoll
Synthasen auf der einen Seite und der Abbau des Second Messengers durch die PDEs auf der anderen Seite, werden als ■ (Denaturierung: 94°C, 3 sec; Annealing: 60°C; 5 sec; PDEs haben einen großen Einfluss auf das physiologische und pathophysiologische Geschehen im Körper und erweisensich sehr gut als Ziel für die Therapie von zahlreichen kör- RFLP SNP45-PDE
perlichen Störungen (Degeneration der Retina, Depression, Beim SNP45 wird am 3’Ende ein Adenin durch ein Gua- Asthma, Erektionsstörungen – „Viagra“, Entzündungen und nin ausgetauscht. Das Restriktionsenzym MAEIII schneidet genau diese mutante Stelle. Somit entsteht aus dem 448bp lan-gen PCR-Produkt ein 302bp und 146bp langes Fragment.
Genstruktur und Genfunktion
Diese Fragmente besitzen eine unterschiedliche Wander- Die Bildung der PDE-Isoformen unterliegt der Kontrolle ungsgeschwindigkeit in der Elektrophorese und wurden mit von verschiedenen Promotern und geht auf das alternative Hilfe eines 100bp Standards ausgewertet.
mRNA-Splicing zurück. Der PDE4D-Genkomplex steht für Der Enzymverdau des PCR-Produkts fand unter folgen- neun unterschiedliche Isoformen und kodiert funktionelle biomed_Heft_0703 16.11.2007 16:11 Uhr Seite 10 Logistic Regression Analysis, Einflussfaktoren
Sie haben einen für Biomedizinische Analytike- der cSVD (adjustiert auf KHK, Fibrinogen, Nikotin, Triglyceride)
rInnen interessanten Vortrag gehört und möch-ten für uns darüber berichten? Oder Sie wollen Variable
Odds-Ratio
uns nur darauf aufmerksam machen? Sie arbeiten selbst in ei- nem wissenschaftlichen Gebiet, das hierher passen könnte?Sie haben im Bereich der Biomedizinischen Analytik eine Di- plomarbeit verfasst, deren Kurzfassung Sie bei uns veröffent-lichen möchten? Dann schreiben Sie uns: [email protected] ■ Restriktionsendonuclease Methanococcus aeolicus III vasculären Insult erkennt, verweist ein Team aus Griechenland auf eine Assoziation des SNP mit dem ischämischen Schlag- anfall und in Rotterdam lieferte eine Fall-Kontroll-Studie ei- Beim SNP45 treten zwei Allele, a und b, auf. Das Allel a ne direkte Verbindung des SNP45 mit der Microangiopathie.
steht für den Basenaustausch von A zu G am 3’Ende, während Dafür verantwortlich sind vermutlich die unterschiedliche beim Allel b kein Basenaustausch stattfindet. Je nach homo- Verteilung der Allele, die nicht alle dasselbe Risiko bergen, und oder heterozygoter Konstellation dieser beiden Allele ergeben das Linkage Dysequilibrium mit Mikrosatelliten.
sich drei unterschiedliche Genotypen.
Vielfach diskutiert ist auch der Mechanismus, über den die Genotyp1 besitzt das Allel a homozygot und in der Elek- PDE als ein Risikofaktor des Schlaganfalls involviert ist. Auf- trophorese erkennt man zwei unterschiedlich große Banden.
grund von Fehlern bei der Transkription durch das alterna- Das heterozygote Auftreten mit den zwei unterschiedlichen Al- tive Splicing kann die Expression oder Funktion der PDE lelen a und b wird als Genotyp2 bezeichnet und resultiert in verändert sein. Geringe cGMP-Spiegel führen zur Plaquebil- drei Fragmenten. Das Allel a wird vom Enzym in zwei Frag- dung und Instabilität der Gefäße. Die Autoregulation wird be- mente geschnitten, während das Allel b nicht verdaut wird und einträchtigt. Eine niedrige PDE-Expression resultiert in ei- somit 448bp lang bleibt. Tritt die Allelkombination bb auf, ner hohen cGMP-Konzentration und schützt durch Prolife- rationshemmung der Myozyten vor endothelilalen Läsionen.
Betrachtet man die blutdruckregulierende Fähigkeit der PDE, so ist zu sagen, dass eine hohe Aktivität eine Minder-perfusion der Arteriolen im Gehirn hervorrufen kann und Im Rahmen dieser Diplomarbeit konnte der SNP45 an folglich das Entstehen von lakunären Infarkten begünstigt.
907 ProbandInnen der ÖSVS untersucht werden. 74 % der Um die Aussagekraft und statistische Signifikanz der Dip- StudienteilnehmerInnen sind TrägerInnen des Genotyps1, lomarbeit zu verstärken, sind eine Erweiterung des Studien- der somit den Wildtyp darstellt. 26 % besitzen den Genotyp2 kollektivs der ÖSVS sowie Expressionsanalysen und die Un- tersuchung eines Microsatelliten in der Nähe des SNP45 not- Durch die Auswertung mittels Statistical Package of So- wendig. Dieses Vorgehen soll zur weiteren Aufklärung der cial Science (SPSS) ergaben sich folgende Aussagen: Rolle der PDE4D bei der Entstehung cerebrovasculärer Er- 1. Die Einflussfaktoren der cSVD wurden mit der Logistic krankungen beitragen. Vielleicht kann in ferner Zukunft das Regression Analysis untersucht. Dabei zeigte sich inner- Schlaganfallrisiko bei Personen, die durch einen PDE4D-Ge- halb des ÖSVS-Kollektivs, im Gegensatz zur isländischen notyp prädisponiert sind, mittels eines Medikaments reduziert Publikation, eine Assoziation des SNP45 mit der Micro- angiopathie. Der p-Value (steht für die Abweichung derDaten vom Mittelwert) des Genotyps3 ist mit 0,055 sig-nifikant.
2. Das erstaunliche Ergebnis lieferte der Odds Ratio, der das Risiko für den Outcome, in diesem Fall für die cSVD,anzeigt. Der Odds Ratio von 0,213 für den Genotyp3 be-deutet ein fünffach geringeres Risiko für die cSVD (Grun-drisiko ist 1) im Vergleich zu Genotyp1 und 2. Das be-deutet, dass der Genotyp3 gegenüber der Microangiopa-thie eine protektive Wirkung besitzt.
Jasmin Strutz
3. Der SNP45 unterliegt keinem Gen-Dosis-Effekt, da das b- Biomedizinische Analytikerin, Onkologie Graz Allel nur in homozygoter Form, als Genotyp3, protektiv wirkt. Die heterozygote Variante im Genotyp2, mit den Al- Ausbildung: Akademie für den medizinisch-technischen Labo- lelen a und b, birgt hingegen ein Risiko für cSVD.
ratoriumsdienst, Graz (2002- 2005)Diplomarbeit: Single Nucleotid Polymorphismen im Stickstoff-monoxid-Phosphodiesterasen-Signaltransduktionsweg – Eine Assoziationsstudie zur Identifizierung genetischer Risikofakto- In den letzen zwei Jahren wurden sehr viele Arbeiten über ren cerebrovasculärer Erkrankungen; Diplomarbeitsstelle: Ins- den Zusammenhang zwischen SNPs der PDE4D und dem titut für Molekularbiologie und Biochemie, Zentrum für mole-kulare Medizin, MedUni Graz; Betreuerin/Erstleserin: Univ.
ischämischen Schlaganfall publiziert. Auffallend ist, dass ei- Prof. DDr. Mas. Helena Schmidt, Zweitleser: Dr. Martin Pichler ne Assoziation der genetischen Instabilität des Lokus 5q12 po- Prämierung der Diplomarbeit mit dem 1. Preis bei der 7. Ge- pulationsabhänging ist. Während zum Beispiel eine australi- meinsamen Fortbildungstagung (Histologie, Zytologie, Mikro- sche Publikation kein Risiko des SNP45 mit dem cerebro-

Source: http://www.biomed-austria.at/fachartikel/schlaganfall_HW07.pdf