Gewinnung und einsatz multispezifischer antikörper als hilfsmit

98 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8. Arbeitsvorschriften
8.1 Reagenzien, Lösungsmittel
Aceton, wasserfrei: Aceton p.a. über Molekularsieb 0,4 nm trocknen Acetonitril, techn., über Kaliumcarbonat destilliert, oder: für die HPLC, ≥ 99,9 %; Aldrich 27,071-7Affi-Prep® Hz hydrazide support; BioRad 156-0015 Aktivkohle, gepulvert, purum, ca. 5 % Asche; Fluka 05120 p-Aminobenzoesäure, BioChemika, > 99 %, rel. Molekülmasse 137,1; Fluka 06930 6-Aminopenicillansäure (6-APA), BioChemika, > 98 %, rel. Molekülmasse 216,3; Fluka 09070 Ammoniumperoxodisulfat, p.a., ≥ 98 %; Roth 9592Ammoniumsulfat, für biochemische Zwecke, > 99,5 %; Merck 1211 Benzylpenicillin, Kaliumsalz; Sigma Pen-K 3H-Benzylpenicillin (3H-Pen-G), 925 MBq, 250 µl; Amersham TRK 779 Bovines Serumalbumin, Fraktion V, receptor grade; Serva 11924 4-Brommethyl-7-methoxycumarin, 97 %; Sigma B-6136 2-Butanol, p.a., ≥ 99,5 %; Merck 9630Calciumchlorid, entwässert, grob gekörnt, rein, > 96 %; Merck 2385 cyanbromidaktivierte Sepharose 4B; Sigma C-9142 Dialyseschlauch, MWCO 12000 - 19000; Serva 44114 Diethanolamin, p.a., ≥ 99,5 %; Merck 16205Diethylether, techn.
Dimethylformamid (DMF), zur Synthese, > 99 %; Merck 822275 Dimethylsulfoxid (DMSO), p.a., > 99,5 %; Merck 2952 Glycin, ≥ 99 %; Sigma G-7126Harnstoff, p.a., > 99,5 %, rel. Molekülmasse 60,1; Merck 8487 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 99
Hexan, p.a., ≥ 99 %; Merck 104367Hyperfilm 3H; Amersham RPN 535 Kaliumbromid für die IR-Spektroskopie; Janssen 20.639.75 Kaliumchlorid, p.a., ≥ 99,5 %; Merck 4936Kaliumdihydrogenphosphat, p.a., ≥ 99,5 %; Merck 4873di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat, p.a., ≥ 99 %; Merck 5099Kaliumhydrogencarbonat, p.a., > 99,5 %, rel. Molekülmasse 100,1; Merck 4854 Kaliumhydroxid, p.a., > 85 %; Merck 5033 Kaliumiodid-Stärke-Papier; Riedel-de Haën 37120 Kaninchen-anti-Huhn-IgG konjugiert an alkalische Phosphatase (sek. AK); Sigma A-9171 Keyhole limpet hemocyanin (KLH); Pierce 77100 Kodak GBX Developer and Replenisher; Sigma P-7042 Kodak GBX Fixer and Replenisher; Sigma P-7167 Kronenether 18-Krone-6, p.a., 99 %; Merck 811684 Natriumacetat, wasserfrei, p.a., ≥ 99 %; Merck 6268Natriumazid, reinst, > 99 %, MW 65,0; Merck 6688 Natriumchlorid, p.a., ≥ 99,5 %; Merck 6404Natriumdihydrogenphosphat-Hydrat, p.a., ≥ 99 %; Merck 6346di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat, p.a., ≥ 99 %; Merck 6579Natriumdodecylsulfat (SDS), für die Elektrophorese, ultra pure, ≥ 99 %; Roth 2326Natriumhydrogencarbonat, p.a., ≥ 99,5 %; Merck 6329Natriumhydroxid, purum p.a, > 97 %; Fluka 71692 Natriumnitrit, puriss. p.a., > 99 %, MW 69,0; Fluka 71759 Nitrocellulosemembran BA 85, 0,45 µm (NC); Schleicher & Schüll 401191 p-Nitrophenylphosphat (PNPP), Dinatriumsalz; Sigma 104-0 ortho-Phosphorsäure, p.a., > 85 %; Riedel-de Haën 30417 Ovalbumin (OVA), BioChemika, > 95 %, 5 x cryst.; Fluka 05440 Oxalylchlorid, zur Synthese, > 98 %, MW 126,9; d = 1,47; Merck 807066 Petrolether, techn., Siedeber. 40 - 60 °C Phenoxymethylpenicillin, Kaliumsalz; Sigma P-1382 Phosphorpentoxid, reinst, ≥ 97 %; Merck 540Polyethylenglycol 6000 (PEG), pract.; Fluka 81260 Polystyrol-Mikrotiterplatte, 96 Kavitäten, U-Form; Greiner 650101 Pyridin, getrocknet, p.a., > 99,5 %; Merck 7463 Quecksilber(II)chlorid, p.a., ≥ 99,5 %; Merck 4419Rotiphorese Gel A, 30 % Acrylamid; Roth 3037 Rotiphorese Gel B, 2 % Bisacrylamid; Roth 3039 Salzsäure (HCl), konz., reinst, > 37 %; Merck 314 100 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
Schwefelsäure, konz., reinst, 95 - 98 %; Merck 713 Serva Blau R, reinst, ≥ 86 %; Serva 35051Stärke, löslich, p.a.; Merck 1252 tert.-Butanol, p.a., > 99,5 %; Merck 9629 Tetrahydrofuran (THF), p.a., > 99,5 %; Merck 9731 TEMED = N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin, reinst, 99 %; Serva 35925 1,2,4-Triazol; Sigma T 7626Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), BioChemika, > 99 %; Fluka 93352 Trockenmagermilch; Frema Reform (aus dem Reformhaus) unspezifisches Kaninchenserum; eigene Gewinnung vor der Immunisierung Wasser, vollentsalzt und in einer Quarzapparatur bidestilliert (Bidest.) Wasser, vollentsalzt, in einer Quarzapparatur bidestilliert und über Kaliumpermanganat destilliert (Tridest.), oder: für die HPLC; Aldrich 27,073-3 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 101
8.2 Lösungen und Puffer1)
0,0025 mo/l Iodlösung/1 g/100 ml Natriumazid in Wasser Kaliumhydrogencarbonatlösung: 60 mmol/l (1,8 g/45 ml) 10 g/100 g: 6 ml o-Phosphorsäure (85 %) auf 50 ml verdünnen (di-)Kaliumhydrogenphosphat, 0,02 mol/l (22,8 g/5 l) mit o-Phosphorsäure auf pH 7,2 einstellen halbges. Ammoniumsulfatlösung: Ammoniumsulfat, 63 g/200 ml unspez. Kaninchenserum (verd.): 1 + 9 mit Wasser verdünnt 2 µl der gelieferten Lösung mit Wasser auf 6 ml verdünnt Tris, 1,5 mol/l (36,3 g/200 ml) SDS, 0,4 g/100 ml (0,8 g/200 ml) Tris, 0,5 mol/l (12,1 g/200 ml) SDS, 0,4 g/100 ml (0,8 g/200 ml) Ammoniumperoxodisulfatlösung: 10 g/100 ml (0,1 g/ml, frisch ansetzen) Tris, 0,625 mol/l (6,1 g/80 ml) SDS, 0,5 g/100 ml (0,4 g/80 ml) Elektrophorese-Puffer (für UltraPhor-Apparatur zweimal ansetzen): Serva Blau R, 0,03 g/100 g Entfärbelösung Methanol/Wasser/Essigsäure 45 + 45 + 10 (v/v/v) 1) Einträge sortiert nach ihrem Erscheinen in den Arbeitsvorschriften 102 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
(di-)Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat, 80 mmol/l (29 g/l) Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat, 20 mmol/l (2,8 g/l) 8 µl der gelieferten Lösung auf 10 ml PBS-T 500 ml PBS-T 5 ml Essigsäure 500 µl Tinte Pelikan 4001, Kodak GBX Developer nach Herstellerangaben ansetzen Kodak GBX Fixer nach Herstellerangaben ansetzen Natriumhydrogencarbonat, 50 mmol/l (4,2 g/l) wie TBST, jedoch ohne TWEEN, mit 5,25 g/100 g PEG PNPP, 25,0 mg in 25 ml Substrat-Puffer lösen (reicht für eine Antigen in TBST so verdünnen, daß 2 µg/Kavität verwendet prim. Antikörper (aus Dotter) in TBST + 0,1 g/100 ml BSA 1 : 30 - 1 : 100000 (8-stufige Verdünnungsreihe) sek. Antikörper (Kaninchen-anti-Huhn-IgG) (di-)Kaliumhydrogenphosphat, 0,1 mol/l (17,4 g/l) mit o-Phosphorsäure auf pH 7,6 einstellen ca. 1 mmol/l (41 µl konz. HCl auf 100 ml Wasser) Natriumhydrogencarbonat, 0,1 mol/l (8,4 g/l) 0,1 mol/l Glycin in Kopplungspuffer, pH auf 8,0 einstellen 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 103
2 mol/l 1,2,4-Triazol, die 0,001 mol/l Quecksilber(II)chlorid a) 13,78 g 1,2,4-Triazol in einem 250 ml Becherglas einwiegen b) 10 ml 0,01 mol/l Quecksilber(II)chlorid-Lösung zugeben c) mit 5 mol/l NaOH auf pH 9 ± 0,5 einstellen d) in einen 100 ml Meßkolben überführen und mit Wasser auf- 0,1 mol/l, mit konz. HCl auf pH 3,0 titrieren (di-)Kaliumhydrogenphosphat, 0,2 mol/l (45,6 g/l l) mit o-Phosphorsäure auf pH 7,2 einstellen 1 mg/ml in Phosphatpuffer (0,2 mol/l, pH 7,2) Brommethylmethoxycumarin-Lösung (kühl und dunkel lagern): 10 mg/ml in wasserfreiem Aceton durch Schüttteln lösen (kein Ultraschallbad!), diese Lösung mit trockenem Aceton um den 1 mg/ml Isoxazolylpenicillin in Wasser (berechnet als freie Säure): 11,3 mg Oxacillin-Natriumsalz bzw. 11,2 mg Cloxacillin-Natriumsalz oder 10,9 mg Dicloxacillin-Natriumsalz 10 µg/ml Isoxazolylpenicillin in Wasser (Stammlösung um den 1 µg/ml Isoxazolylpenicillin in Wasser (Arbeitslösung I um den 1 mg/ml Benzylpenicillin in Wasser (berechnet als freie Säure): 11,1 mg Benzylpenicillin-Kaliumsalz in 10 ml Wasser Arbeitslösung I Benzylpenicillin: 10 µg/ml Benzylpenicillin in Wasser (Stammlösung um den Arbeitslösung II Benzylpenicillin:1 µg/ml Benzylpenicillin in Wasser (Arbeitslösung I um den Glycinpuffer, 0,2 mol/l, pH 3,0 mit konz. HCl + Acetonitril 104 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.3 Laborgeräte
Anmerkung: Zur Vermeidung von Adsorptionsverlusten an Glasoberflächen müssen alle Kolben- Meß- und Vollpipetten und Reagenzgläser, die mit Pencillin-Lösungen oder penicillinhaltigen Proben in Berührung kommen, wie bei [46] desaktiviert werden. Reagenzgläser, 10 ml, mit Schraubdeckel und PTFE-beschichteter Gummidichtung (Corning, Wies- Reaktionsgefäße, konisch geschliffen, 1 ml (Supelco, Bad Homburg) Einmal-Reaktionsgefäße, 1,5 ml (Eppendorf, Hamburg) Polystyrol-Leersäulen mit Fritten und Verschlußkappen (Pierce, Oud Beijerland/NL) Leersäule, 10 cm x 1 cm i.D.; Pharmacia C 10/10, Nr. 19-5001-01 (Pharmacia, Freiburg) Leersäule; Pharmacia HR 5/2, Nr. 18-0382-01 (Pharmacia, Freiburg) Tischzentrifuge: Hermle Z 230 (Eppendorf, Hamburg) Zentrifuge, kühlbar: Centrikon H-401 B (Kontron, München) Gefriertrocknungsanlage: Alpha (Christ, Osterode) Vibrationsmischer: Vortex- Genie (Bender & Hobein, Zürich/CH) Ultraschallbad: Sonorex RK 100 (Bandelin, Berlin) Heizblock mit Einsatz für 12 Reaktionsgefäße: Multi-Blok Heater (Supelco, Bad Homburg) Rotationsverdampfer: RE 111 (Büchi, Flawil/CH) pH-Meter mit Glaselektrode: 646 (Knick, Berlin) Quecksilber-Niederdrucklampe: Nr. 015376, 15 W (Heraeus, Karlsruhe) Elektrophoresekammer: MiniGel (BioRad, München) oder UltraPhor (Colora, Lorch) Blottingkammer: TransBlot (BioRad, München) Mikrotiterplatten-Lesegerät: Modell 450 (BioRad, München) Universalzerkleinerer: Moulinette 643 (Moulinex, Köln) 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 105
8.3.3 Geräte für die Spektroskopie und Chromatographie UV-Betrachtungsgerät (Desaga, Heidelberg) Selbstregistrierendes Spektralphotometer: UV 300 (Shimadzu, Duisburg) Spektralphotometer: PU 8620 (Philips, Kassel) Infrarotspektrometer: PU 9706 (Philips, Kassel) Szintillationszähler: LS 1701 (Beckmann, München) Chromatographische Ausrüstung:
Niederdruckgradientenpumpe 655 A-11 (Merck, Darmstadt) isokratische Pumpe L-6000 A (Merck, Darmstadt) On-line Sample Preparator OSP-2 (Merck, Darmstadt) HPLC-Säulenofen 125 (ERC, Alteglofsheim) photochemischer Reaktor BeamBoost™ mit Reaktionskapillare 25 m, Best.-Nr. IC88506 (ICT, UV-Vis-Detektor SPD-6AV (Shimadzu, Duisburg) elektronisches Niederdruckschaltventil: LMV 870 (Kontron Instruments, Neufahrn) elektronisches 6-Wege-Schaltventil ELV 7000 (W. Kranich, Göttingen) Probenschleifen-Set Nr. 18-5897-01 (Pharmacia, Freiburg) Dilutor 401 mit 10 ml Spritze (Abimed, Langenfeld) Peristaltische Pumpe: Microperpex S (Pharmacia, Freiburg) Peristaltische Pumpe: P 1 (Pharmacia, Freiburg) Fraktionssammler: FRAC-100 (Pharmacia, Freiburg) UV-Durchflußzelle: UV 1 (Pharmacia, Freiburg) 106 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.4 Synthese des 6-APA-Immunogens
8.4.1 Darstellung von p-Azidobenzoesäure [152 (mod.)] 1. 13,7 g (100 mmol) p-Aminobenzoesäure in 150 ml bidest. Wasser in einem mit Thermometer und Tropftrichter bestückten 2 l-Dreihalskolben suspendieren.
2. 20 ml konz. Schwefelsäure zugeben (entspr. 2,1 mol/l Reaktionsgemisch), mit einer Eis-Kochsalz- 3. 7,6 g (110 mmol) Natriumnitrit in 75 ml bidest. Wasser lösen, mittels Tropftrichter innerhalb von Die Suspension wird im Verlauf der Reaktion klar und gelb.
4. Ende der Reaktion mit Kaliumiodid-Stärke-Papier kontrollieren: 5 min nach der letzten Zugabe von Natriumnitrit muß ein leichter Überschuß an salpetriger Säure nachweisbar sein.
Ein eventuell großer Überschuß muß mit Harnstoff vorsichtig zerstört werden.
Alle weiteren Schritte sind im stark gedämpften Licht durchzuführen!
6. 13 g (200 mmol) Natriumazid in 60 ml Wasser lösen, mittels Tropftrichter innerhalb von 15 min 7. Nach Beendigung der Stickstoffentwicklung 20 min weiterrühren.
8. Produkt absaugen, mit Eiswasser nachwaschen.
9. In der minimalen Menge (ca. 400 ml) heißem Ethanol lösen, Filterpapierschnitzel und eine Spatelspitze gepulverte Aktivkohle zugeben.
10. Durch mit heißem Ethanol angefeuchteten, warmen Filter filtrieren.
11. Abkühlen lassen und über Nacht bei - 20 °C stehen lassen.
13. Filtrat am Rotationsverdampfer bei 50 °C Wasserbadtemperatur eindampfen, bis Trübung eintritt 14. Abkühlen lassen und 2 Stunden bei -20 °C stehen lassen.
15. Erneut ausgefallenes Produkt absaugen.
16. Gesamte Produktausbeute in minimaler Menge heißem Ethanol/Wasser (1 + 1, v/v) (500 - 600 ml) 17. Durch mit heißem Ethanol/Wasser angefeuchteten Filter filtrieren.
18. Abkühlen lassen, bei 0 °C auskristalisieren lassen.
19. Produkt absaugen, zuerst mit der Mutterlauge, dann mit kaltem Ethanol/Wasser waschen.
20. Produkt über Phosphorpentoxid unter Vakuum bei Raumtemperatur trocknen.
21. Auseute: ca. 60 % = 9,8 g (16,3 g = 100 %); rel. Molekülmasse = 163,1 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 107
Kieselgel F, Petrolether/Diethylether/Eisessig (8 + 5 + 10, v/v/v), Det. UV 254 nm Produkt und Edukt in THF lösen (1 mg/ml) keine Banden bei 3440 und 3340 cm-1 von Aminen Schmelzpunkt: 182 - 183 °C (Galardy et al.: 183 °C (Zers.), p-Aminobenzoesäure: 186 - 188 °C) 8.4.2 Synthese von p-Azidobenzoylchlorid [155, 156 ] 1. Technisches Acetonitril über Phosphorpentoxid destillieren (Sdp. 81 °C) und über Molekularsieb 2. 6,0 g (37 mmol) p-Azidobenzoesäure in einem 100 ml Rundkolben in 15 ml Acetonitril suspendieren.
3. Unter Rühren 3,8 ml (5,6 g = 44 mmol) Oxalylchlorid zugeben.
4. 20 µl DMF zugeben, Kolben mit einem mit Calciumchlorid gefüllten Trockenrohr verschließen.
5. Reaktionsgemisch unter Rühren auf ca. 40 °C erwärmen.
6. 3 Stunden weiterrühren, die Lösung wird dabei gelblich und die Azidobenzoesäure geht dabei fast 7. Suspension mehrere Stunden auf - 20 °C abkühlen, es fallen gelbliche Kristalle aus.
8. Kristalle absaugen und verwerfen (nicht umgesetzte Säure, per DC identifiziert).
9. Acetonitril bei 150 mbar, 40 °C Wasserbadtemperatur am Rotationsverdampfer entfernen.
10. Rückstand unter leichtem Erwärmen auf max. 40 °C in etwa 15 ml Cyclohexan lösen, vom Unlöslichen abgießen, mit Cyclohexan nachwaschen.
11. Lösung bei 250 mbar, 40 °C auf etwa 15 ml einengen, bei - 20 °C kalt stellen.
12. Auskristallisiertes Säurechlorid absaugen, flüssige Phase auf 5 bis 10 ml einengen (250 mbar, 40 °C) und bei - 20 °C 2 Stunden kalt stellen.
14. Das gelbliche Rohprodukt unter Erwärmen auf ca. 40 °C in etwa 15 ml Petrolether lösen, durch Abkühlen auf - 20 °C (2 Stunden) ausfällen und absaugen.
15. Einengschritt und Ausfällen wiederholen.
16. Im Stickstoffstrom vortrocknen, im Exsiccator unter Vakuum nachtrocknen.
17. Ausbeute: 50 % = 3,4 g (100 % = 6,7 g), lange weiße Nadeln, rel. Molekülmasse = 181,6 108 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
Kieselgel F, Toluol/Essigester (6 + 4, v/v), Det. UV 254 nm Produkt und Edukt in Aceton lösen ( 1 mg/ml) C=O-Valenz von Säurechloriden bei 1720 und 1755 cm-1 keine C=O-Valenz von aromatischen Carbonsäuren bei 1660 cm-1 8.4.3 Darstellung von p-Azidobenzoylpenicillin [161] 1. 1,5 g (7,0 mmol) 6-APA in 45 ml 60 mmol/l Kaliumhydrogencarbonatlösung und 40 ml Aceton 2. Unter Rühren und Eisbadkühlung eine Lösung von 1 g (5,5 mmol) p-Azidobenzoylchlorid in 20 ml Aceton innerhalb von 30 min zutropfen.
3. Eiskühlung entfernen und 60 min weiterrühren.
4. Aceton am Rotationsverdampfer entfernen (40 mbar, 40 °C) 5. Wäßrige Phase mit 3 x 50 ml Diethylether zur Entfernung nicht umgesetzter Ausgangsprodukte extrahieren, Etherphasen (obere Phasen) verwerfen.
6. 50 ml Diethylether zugeben, auf 5 °C abkühlen, mit Phosphorsäure vorsichtig auf pH 2,5 ansäuern, kurz schütteln und nach Phasentrennung Etherphase abtrennen.
7. Nochmals mit 50 ml kaltem Diethylether extrahieren.
8. Vereinigte Etherphasen mit 35 ml kaltem Wasser waschen.
9. 150 ml kaltes Wasser zugeben, mit 1 mol/l Kaliumhydroxidlösung im Eisbad auf pH 7,2 titrieren.
10. Wäßrige Phase abtrennen, Extraktionsvorgang zweimal wiederholen.
11. Vereinigte wäßrige Phasen einfrieren und lyophilisieren.
12. Ausbeute: 70 % (1,99 g = 100 %), weißes Pulver; rel. Molekülmasse = 361,4 Kieselgel F, tert. Butanol/Wasser (1 + 19, v/v) (mod. nach [162]) 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 109
nacheinander in beide Lösungen tauchen oder sprühen 4-Azidobenzoylpenicillansäure-6-amid sowie 6-APA erscheinen weiß auf blauem p-Azidobenzoesäure und das 4-Azidobenzoylpenicillin sind im UV sichtbar.
keine C=O-Valenz von Säurechloriden bei 1720 und 1755 cm-1 scheinen, wird jedoch in D O vollständig 1. 20 mg des p-Azidobenzoylpenicillins ( entspr. 12 mg 6-APA) in 10 ml Phosphatpuffer (0,02 mol/ 2. 100 mg OVA oder KLH in 10 ml Phosphatpuffer (0,02 mol/l, pH 7,2) lösen, das 6-APA-Derivat in 1-ml-Schritten zugeben und mit einer Quecksilbergasentladung-Lampe bei Eiskühlung bestrahlen.Vor jeder erneuten Zugabe sollen mindestens 50 % des vorher zugegebenen Azids 3. Lösung 2 Tage gegen Wasser dialysieren.
4. Dialysat einfrieren und lyophilisieren.
110 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.5 Radioimmunoassay zur Titer- und Spezifitätsbestimmung [79]
1. 10 1,5 ml-Reaktionsgefäße bereitstellen.
2. Serum in Gefäß 1 1 + 9 mit PBS verdünnen.
3. 300 µl PBS in die Gefäße 2 - 10 vorlegen.
4. 300 µl verdünntes Serum aus Gefäß 1 in Gefäß 2 geben, mischen.
5. 300 µl aus Gefäß 2 in Gefäß 3 geben, mischen.
In den Reaktionsgefäßen 1 - 10 befinden sich die Serumverdünnungen 10 x 20 bis 10 x 29.
7. In 10 weitere Reaktionsgefäße 100 µl Wasser vorlegen.
8. 100 µl 3H-Pen G-Lösung zupipettieren (=553 pg/100 µl).
9. 100 µl unspezifisches Kaninchenserum (verd.) zugeben.
10. 100 µl der jeweiligen Serumverdünnung zugeben.
11. Mischen, mind. 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
12. 400 µl gesättigte Ammoniumsulfatlösung in 100 µl Schritten zugeben.
13. Zentrifugieren (5 min, 10000min-1 = 12000 x g), Überstand verwerfen.
14. Pellet in 400 µl halbgesättigter Ammoniumsulfatlösung suspendieren.
15. Zentrifugieren, Überstand verwerfen.
16. Pellet in 400 µl Wasser lösen, Lösung in Zählröhrchen überführen.
17. Reaktionsgefäß mit 2 x 200 µl Wasser nachspülen.
18. 4,5 ml Szintillatorflüssigkeit zugeben, mischen.
19. Röhrchen im Szintillationszähler 5 min oder bis Fehler < 2% messen.
Zur Bestimmung der Spezifität wird die Serumverdünnung verwendet, die dem Titer entspricht. die Schritte 1 - 6 entfallen. In Schritt 7 wird nicht Wasser, sondern jeweils 100 µl einer Lösung des Kompetitors in Wasser mit verschiedenen Konzentrationen verwendet.
8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 111
8.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [173]
(Die Montagehinweise gelten für die Ultra-Phor-Apparatur. Sie müssen bei der Verwendung ande- rer Apparaturen entsprechend abgewandelt werden.) 1. Glasplatten und Geltaschenkamm mit Spülwasser waschen, Glasplatten mit Aceton nachspülen, 2. Elektrophorese-Apparatur komplett zusammenbauen. Vor dem Festschrauben des unteren Einsat- zes Deckel aufschrauben. Frontplatte noch nicht montieren.
3. Trenn-Gele (für 2 Gele, 2 mm, 7,5 % Polyacrylamid) Gel mischen und mit Einwegspritze in die Gelkammer einfüllen.
4. Gel mit wassergesättigtem 2-Butanol überschichten und mind. 2 Stunden polymerisieren lassen.
Butanol vom Trenngel mit Filterpapier absaugen und Sammelgel überschichten. Mit Kamm 6. Slots und Sammel-/Trenngelgrenze mit einem Folienschreiber markieren, Frontplatte aufschrauben und Elektrophoresepuffer einfüllen. Unterkante von Luftblasen befreien.
7. Auf 4 - 8 °C temperieren und Gel über Nacht polymerisieren lassen.
112 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
1. Kamm entfernen, Geltaschen mit Elektrophoresepuffer füllen. Der Puffer darf jedoch nicht über der 2. Leerstellen mit Probenpuffer, der etwas Bromphenolblau enthält, füllen.
3. Proben in Wasser aufnehmen (1 mg/ml) und 1 + 1 mit Probenpuffer verdünnen, 10 min auf 95 °C erhitzen, im Eisbad kühlen und aufgeben. Bei Antikörpern, die geblottet werden sollen, darf keine 4. Elektrophorese mit 40 mA/Gel beginnen, sobald die Proben das Trenngel erreicht haben, Strom auf Wenn geblottet werden soll, darf das Gel vorher nicht gefärbt werden.
1. Puffer aus der Apparatur ablassen, Apparatur demontieren, Gel mit Glasplatten entfernen.
2. Färbelösung in die Färbewanne geben, Gel vorsichtig hineinlegen, unter Schütteln über Nacht 3. Färbelösung abgießen, Gel mit Entfärbelösung waschen. So lange unter Schütteln und häufigem Wechseln der Entfärbelösung entfärben, bis der Gelhintergrund klar ist.
4. Zum letzten Entfärber 5 % Glycerin geben.
5. Gel aus der Lösung nehmen, auf ein mit der letzten Entfärberlösung getränktes Stück Einmachcellophan legen, Gel mit Cellophan abdecken und unter Vakuum bei 60 °C trocknen.
8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 113
8.7 Immunblot [185, 187]
1. Gel kurz mit Transferpuffer spülen.
2. Watte aus der Blotting-Kammer mit Transferpuffer tränken und auf das Gitter legen.
3. Filterpapier mit Transferpuffer tränken und auf die Watte legen.
5. Nitrocelluloseme-Membran mit Transferpuffer tränken und auf das Gel legen.
6. Filterpapier mit Transferpuffer tränken und auf die Membran legen.
7. Watte mit Transferpuffer tränken und auf das Filterpapier legen.
8. Gitter darüberklappen und das gesamte Paket in die Blotting-Kammer einsetzen. Nitrocellulose- 9. 3 Stunden bei 30 V, 200 mA (ca. 3,75 V/cm) transferieren.
10. Filter und Gele der Apparatur entnehmen.
11. Gele in Coomassie R 250 färben.
12. Filter über Nacht in PBS-T bei 4 °C lagern.
13. Blocken der unbesetzten Bindungsstellen mit PBS-T + 5 g/100 ml Trockenmagermilch.
14. Spülen der Nitrocellulose-Membran mit PBS-T.
15. 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 3H-Pen G-Lösung inkubieren.
16. 3H-Pen G-Lösung abpipettieren, 4 x mit PBS-T waschen.
17. Nitrocellulose-Membran bei Raumtemperatur trocknen (ca. 2 Stunden).
18. Hyperfilm 3H 10 - 14 Tage exponieren, Lage der Nitrocellulose bei Rotlicht mit schwarzem 19. Film entwickeln, stoppen, fixieren und trocknen.
20. Nitrocellulose-Membran 5 min in Natriumhydroxidlösung baden.
22. 2 h bis über Nacht in Färbelösung färben.
24. An der Luft bei Raumtemperatur trocknen.
114 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.8 ELISA (Indirect Antigen Coated Plate (IACP) ELISA) [188]
4. Bei 2500 * g, 4 °C 30 min zentrifugieren, Überstand (bereits 3-fach verdünnt!) verwenden.
1. Mikrotiterplatte über Nacht bei 4 °C oder 2 h bei 37 °C mit Antigen beschichten.
Antigenkonzentration: 20µg/ml, 100 µl/Kavität = 2 µg/Kavität 3. Über Nacht bei 4 °C oder 2 h bei 37 °C mit Block-Puffer blockieren.
5. 2 h bei 4 °C oder 1 h bei 37 °C mit 100 µl prim. AK in geeigneter Verdünnung inkubieren.
7. 2 h bei 4 °C oder 1 h bei 37 °C mit 100 µl sek. AK inkubieren.
9. 250 µl Substrat-Lösung zugeben, 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Zur Bestimmung des Antikörpertiters wird in Schritt 5. eine Verdünnungsreihe, beispielsweise von Faktor 10 - 30.000 in 8 Stufen eingesetzt.
Zur Bestimmung der Spezifität wird in Schritt 5. die Verdünnung des primären Antikörpers gewählt, mit der 50 % der maximalen Extinktion erzielt wird. Vor der Antikörperzugabe werden 10 - 100 µl des zu testenden Inhibitors in verschiedenen Konzentrationen zupipettiert.
8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 115
8.9 Isolierung von Immunglobulin G [59]
Alle nachfolgenden Schritte müssen in einem im Kühlschrank stehenden Eisbad ablaufen! 2. Innerhalb 1/2 Stunde unter Rühren gesättigte Ammoniumsulfatlösung bis zu einer Endkonzentration Zugabe an ml ges. (NH4)2SO4 = (% Sättigung x Anfangsvolumen)/(100 - % Sättigung) 4. 10 - 15 min bei 4000 * g, 4 °C, zentrifugieren.
5. Überstand in ein weiteres Zentrifugenglas überführen, Präzipitat verwerfen.
6. Innerhalb 1/2 Stunde unter Rühren gesättigte Ammoniumsulfatlösung bis zu einer Endkonzentration 8. Niederschlag abzentrifugieren (wie oben), Überstand verwerfen.
9. Präzipitat im Ausgangsvolumen PBS lösen.
10. Innerhalb einer Stunde unter Rühren das gleiche Volumen gesättigte Ammoniumsulfatlösung 12. IgG abzentrifugieren (wie oben).
13. IgG in PBS lösen und gegen PBS dialysieren, lyophilisieren.
116 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.10 Isolierung von IgY [141]
2. 4-faches Volumen Phosphatpuffer pH 7,6 zugeben 3. Unter Rühren 3,5 g Polyethylenglykol (PEG)/100 ml Dotterlösung zugeben, 30 min rühren.
4. Bei 2500 * g, 4 °C 20 min zentrifugieren.
5. Überstand durch Glaswolle in einen Meßzylinder filtrieren.
6. 8,5 g PEG/100 ml Lösung unter Rühren zugeben (Endkonz. PEG = 12 g/100 ml), 30 min rühren.
Entfernung des Polyethylenglykols mittels Ammoniumsulfatfällung und Dialyse: 9. Präzipitat zu 15 ml in Phosphatpuffer pH 7,6 lösen.
10. 15 ml ges. Ammoniumsulfatlösung langsam unter Rühren und Kühlung zugeben.
11. 10 min stehenlassen, wie oben zentrifugieren.
12. Es entsteht ein Dreiphasensystem: Die bere Phase enthält Protein und PEG, die mittlere Puffer und Obere Phase abtrennen, in 10 ml ges. Ammoniumsulfatlösung suspendieren, zentrifugieren.
13. Mittlere Phasen aus beiden Zentrifugationen und obere Phase aus der zweiten Zentrifugation verwerfen, untere Phasen (Präzipitate) in Ammoniumsulfat suspendieren, zentrifugieren.
14. Präzipitate in Phosphatpuffer pH 7,6 lösen und vereinigen.
15. Gegen 2 x 1,5 l PBS dialysieren, anschließend lyophilisieren oder zur Affinitätsreinigung verwen- Alternativ kann zur Entfernung des Polyethylenglykols die Ultrafiltration eingesetzt werden. Dieses Verfahren eignet sich nur für kleinere Mengen: 9. Präzipitat zu 200 ml/Dotter in PBS lösen.
10. Lösung einer Ultrafiltration unterwerfen (MWCO 30.000) 11. Erfolgt die Ultrafiltration aufgrund der hohen Viskosität von Polyethylenglycol zu langsam, kann 12. Das Ultrafiltrat kann lyophilisiert oder zur Affinitätsreinigung weiterverwendet werden.
8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 117
8.11 Präparation des Haptensorbens [79]
1. 1,5 g Fractogel® TSK AF-CDI 1 Stunde in HCl (1 mmol/l) quellen lassen, abdekantieren.
2. Kopplungspuffer zugeben, suspendieren, absitzenlassen, abdekantieren.
4. Puffer über G4-Fritte absaugen und Fractogel mit Kopplungspuffer waschen.
5. Fractogel mit einem Plastikspatel in einen 50 ml Rundkolben überführen.
7. Über Nacht am Rotationsverdampfer langsam drehend bei Raumtemperatur reagieren lassen.
8. Fractogel-6-APA-Konjugat in eine Säule überführen, mit 2 Säulenvolumina Kopplungspuffer spülen (erzieltes Säulenvolumen: 6 ml). Eluat zur Bestimmung der Kopplungsrate sammeln.
9. Säule zum Blockieren der underivatisierten aktiven Gruppen mit 100 ml Glycin-Lösung spülen.
Kopplungsrate indirekt über nicht gebundene 6-APA nach Boison et al. [35] bestimmen.
8.12 Bestimmung von 6-Aminopenicillansäure [35]
5 Lösungen mit Konzentrationen zwischen 0 und 20 mg/10 ml 6-APA in 0,1 mol/l Natriumhydrogen- 1. Je 500 µl der Standardlösungen in verschließbare Reagenzgläser pipettieren, 500 µl Wasser 2. 1 ml Reagenzlösung nach Boison et al. zugeben, mischen.
3. 30 min im Wasserbad bei 65 °C inkubieren.
4. Abkühlen der Reagenzgläser durch Einstellen in kaltes Wasser.
5. Extinktion gegen Blindlösung bei 325 nm messen.
Mit 500 µl des lyophilisierten Eluates von der Präparation der Haptensäule analog verfahren.
Oberhalb von 2,0 Extinktionseinheiten ist die Detektion nicht mehr linear. Die besten Ergebnisse sind im Konzentrationsbereich von 7 µg/500 µl bis 85 µg/500µl (0,18 - 2,0 Extinktionseinheiten) zu 118 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.13 Affinitätsreinigung von Immunglobulin Y
1. 3 ml einer Lösung von IgY aus der PEG-Fällung (5 - 10 mg/ml) in PBS auf die Haptensäule 2. Mit PBS spülen, bis keine Extinktion bei 280 nm mehr vorhanden ist.
Die Elution erfolgt in zwei Fraktionen. Die erste Fraktion wird gesammelt, die zweite verworfen.
4. Glycinpuffer im Eluat per Ultrafiltation (MWCO 30.000) gegen PBS austauschen.
8.14 Immobilisierung von Antikörpern an Cyanbromid-Sepharose
1. 0,5 g der Sepharose (entspr. 1,75 ml Gel) mit eiskalter HCl (1 mmol/l) quellen lassen und in einer 2. Sepharose mit Kopplungspuffer waschen und trocken saugen.
3. Sepharose schnell in 4 ml der Immunglobulin-Lösung geben (2 - 2,5 mg/ml Kopplungspuffer) ca.
4. 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C unter Rotation am Rotationsverdampfer 5. Gel in Glycinlösung überführen.
6. 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C unter Rotation am Rotationsverdampfer 7. Gel in eine Säule überführen, mit ca. 50 ml Kopplungspuffer waschen.
8. Säule mit ca. 50 ml Elutionspuffer waschen.
9. Säule mit ca. 50 ml Kopplungspuffer waschen.
Kopplungsrate indirekt über nichtgebundenes Protein durch Messung von E(280 nm) bestimmen.
8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 119
8.15 Ermittlung der Säulenkapazitäten [43]
Die Immunaffinitätssäulen wurden unter folgenden Bedingungen betrieben: - Lagerung, Probenaufgabe und Waschen und Equilibrieren der Säule mit PBS, pH 7,2 - Elution mit Glycinpuffer, pH 3,0 + Acetonitril (9 + 1) Zur Bestimmung der Kapazität mittels HPLC: 1 ml einer Lösung von 1 µg/ml Benzylpenicillin in PBS aufgeben.
2 Waschfraktionen mit je 5 ml sammeln.
2 Elutionsfraktionen mit je 5 ml sammeln.
Die Elutionsfraktionen mit je 2 ml Phosphatpuffer neutralisieren.
Alle Fraktionen mit 1 ml Kronenetherlösung (18-cr-6, 1 mg/ml in Phosphatpuffer, 0,2 mol/l, pH Mit 2 x 2 ml Dichlormethan extrahieren.
Die Extrakte durch Aufblasen von Stickstoff vei 37 °C zur Trockene eindampfen.
10. 100 µl Brommethylmethoxycumarinlösung zugeben und 1 Stunde bei 60 °C derivatisieren.
11. Per HPLC analysieren (RP-18-Säule temperiert auf 35 °C, Natriumacetatpuffer, 0,05 mol/l, pH 4,5/Acetonitril (53 + 47, v/v), Detektion: Fluoreszenz, Anregung: 300 nm, Emission: 400 nm) 120 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.16 Dotieren der Matrices
Das Dotieren der Milch mit 30 µg/kg Isoxazolylpenicillin erfolgte nach folgendem Schema: 1. Zu 5 ml Milch 15 µl Arbeitslösung I (10 µg/ml) geben.
2. 10 Sekunden auf dem Vibrationsmischer mischen.
3. Mindestens 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
Das Dotieren der Milch mit 4 µg/kg Benzylpenicillin erfolgte nach folgendem Schema: 1. Zu 5 ml Milch 20 µl Arbeitslösung II (1 µg/ml) geben.
2. 10 Sekunden auf dem Vibrationsmischer mischen.
3. Mindestens 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
8.16.2 Dotieren von Rindermuskel und Rinderleber Rindermuskel und -leber wurde mit 300 µg/kg Isoxazolylpenicillin nach dem folgenden Schema 1. Rindermuskel/-leber in einem Universalzerkleinerer homogenisieren.
2. 5 g des Homogenats abwiegen und mit 15 µl der Arbeitslösung I (10 µg/ml) versetzen.
3. Pencilline mit einem Glasstab in die Matrix einarbeiten.
4. Mindestens 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
Die Dotierung von Rindermuskel und -leber mit 30 µg/kg Benzylpenicillin erfolgte sinngemäß: 1. Rindermuskel/-leber in einem Universalzerkleinerer homogenisieren.
2. 5 g des Homogenats abwiegen und mit 15 µl der Arbeitslösung II (1 µg/ml) versetzen.
3. Pencilline mit einem Glasstab in die Matrix einarbeiten.
4. Mindestens 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
8. ARBEITSVORSCHRIFTEN 121
8.17 Extraktion der Penicilline aus Lebensmitteln
8.17.1 Extraktion der Penicilline aus Milch 1. 10 ml Milch durch Zentrifugation bei 2000 * g, 4 °C entfetten.
2. 5 ml der entfetteten Milch unter der Fettphase abpipettieren.
3. Entfettete Milch durch Ultrafiltration (MWCO 30.000) deproteinieren.
4. 1 ml des klaren Filtrates mit Natriumchloridlösung auf 10 ml verdünnen.
5. Verdünntes Filtrat zur Immunaffinitätsaufreinigung einsetzen.
8.17.2 Extraktion der Penicilline aus Rindermuskel 1. Rindermuskel in einem Universalzerkleinerer homogenisieren.
3. 5 ml Extraktionslösung (Acetonitril/Natriumchloridlösung 1 + 1) zupipettieren.
5. 30 s auf dem Vibrationsmischer mischen.
6. 5 min im Ultraschallbad extrahieren.
7. 20 min bei 2000 * g, 4°C zentrifugieren.
8. Wäßrige Phase unter der Hexanphase abpipettieren, Hexan- und Fettphase verwerfen.
10. Wäßrige Phasen vereinigen, mit Natriumchloridlösung auf 10 ml auffüllen.
11. 2 min bei 2500 * g zentrifugieren.
12. 250 µl des klaren Extraktes mit Natriumchloridlösung auf 10 ml verdünnen.
13. Verdünnten Extrakt zur Immunaffinitätsaufreinigung einsetzen.
Anmerkung: Soll dotiertes Muskelfleisch extrahiert werden, entfallen die Schritte 1. und 2.
122 8. ARBEITSVORSCHRIFTEN
8.17.3 Extraktion der Penicilline aus Rinderleber 1. Rinderleber in einem Universalzerkleinerer homogenisieren.
3. 5 ml Extraktionslösung (Acetonitril/Natriumchloridlösung 1 + 1) zupipettieren.
4. 30 s auf dem Vibrationsmischer mischen.
5. 5 min im Ultraschallbad extrahieren.
6. 20 min bei 2000 * g, 4°C zentrifugieren.
9. Wäßrige Phasen vereinigen, mit Natriumchloridlösung auf 10 ml auffüllen.
10. 2 min bei 2500 * g zentrifugieren.
11. 500 µl des klaren Extraktes mit Natriumchloridlösung auf 10 ml verdünnen.
12. Verdünnten Extrakt zur Immunaffinitätsaufreinigung einsetzen.
Anmerkung: Soll dotierte Leber extrahiert werden, entfallen die Schritte 1. und 2.
8.18 Immunaffinitätschromatographie von Lebensmittelextrakten
Die Immunaffinitätschromatographie wurde on-line mit der HPLC gekoppelt. Die Verbindung der Komponenten ist in Anhang I skizziert.
Die Aufgabe sämlicher Puffer und Probenextrakte erfolgte mit Hilfe des Dilutors, dessen Programmierung ebenfalls in Anhang I zu finden ist.
1. Equilibrieren der Immunaffinitätssäule mit 5 ml PBS.
2. Aufgabe von 2 * 5 ml Probenextrakt.
4. Elution mit 5 ml Elutionspuffer. Das Eluat wird in einer 5 ml-Probenschleife gesammelt und der 5. Regenerieren der Säule mit 5 ml PBS.

Source: http://www.pdeleuw.de/diss/pdf/8vorschriften.pdf